Методи діагностики вірусних і віроідних хвороб ратстеній

Метод візуальної діагностики

У більшості випадків визначити вірусну природу хвороби не важко. Зазвичай її визначають за зовнішніми ознаками, таким як лінійні хлоротичні візерунки або кільцеві візерунки на молодому листі. Однак, їх ідентифікація часто утруднена, так як віруси мають безсимптомний (латентний) характер розвитку. Симптоматика залежить від стану організму, агресивності штаму патогена, зовнішніх умов і тривалості перебування вірусу або віроїди в клітинах господаря. Наприклад, симптоми захворювання чітко виражені у рослин, що росли на яскравому світлі і при помірній температурі, при високій температурі і недостатньому освітленні симптоматика захворювання може бути зовсім не виражена.

Посветленіе жилок наймолодших листя нерідко є одним з перших ознак системної вірусної інфекції. Жилки стають жовтими і напівпрозорими. Листя, що утворюються пізніше, можуть бути мозаїчними, краплистими або зовсім жовтими (хлоротичними).

Інкубаційний період захворювання залежить від виду вірусу, рослини-господаря і умов середовища, але в будь-якому випадку він становить кілька днів або тижнів.

Якщо перші симптоми вирозов помітні на розсаді, то джерело інфекції знаходився або в насінні, або зараження відбулося при посередництві переносника. Якщо заражені рослини розташовані в культурі абсолютно випадково або ж тільки в рядках, посаджених з однієї партії, то це говорить про те, що, швидше за все, був заражений посадковий матеріал. Якщо на окремих ділянках поля виявляються хворі рослини, причому поява заражених ділянок пов`язано з грунтовими відмінностями, є всі підстави припускати поширення вірусів через грунт.

Слід зазначити також, що існують симптоми, властиві вирозов, але викликані іншими причинами (ураження фітоплазми, деякими бактеріями і смокчуть шкідниками). До появи симптомів, схожих з вірусною інфекцією, часто призводять порушення мінерального живлення, наприклад, пов`язані з дефіцитом заліза (Рис. 1). Різні деформації органів можуть викликати регулятори росту і гербіциди різної природи (Рис. 2).

Таким чином, за допомогою методу візуальної діагностики, точної ідентифікації за зовнішніми ознаками ураження вірусами і віроїди неможлива, однозначну відповідь може бути отриманий тільки з використанням інструментальних методів (імуноферментний аналіз, ПЛР-аналіз і т. Д.).

Метод індикаторний рослин

Метод індикаторних рослин - є дуже поширеним методом діагностики вірусних і віроідних хвороб та ідентифікації їх збудників. В основу методу індикаторних рослин покладено використання рослин-індикаторів, які, в більшості випадків дають чіткі і специфічні симптоми, характерні для певного виду патогена. Трав`янисті рослини-індикатори заражають механічної инокуляцией соком, в результаті зараження може проявлятися у вигляді місцевих некрозів, зміною забарвлення і пригніченням росту.

Для вірусу аспермии томата як індикатор використовують молоді рослини тютюну (Nicotiana glutinosa), Для діагностики Х-вірусу картоплі - амарант кулястий (Gomphrena globosa). Для виявлення зараженості томата віроїди веретеновидними бульб картоплі в якості індикаторів використовують Скополія (Scopolia sinensis) Або чутливі сорти томата. У ряді випадків для зараження можна використовувати окремі ізольовані листя рослин-індикаторів. Соконепереносімие віруси прищеплюють на індикаторні рослини різними методами. У рідкісних випадках, щоб для передачі вірусу використовують комах-преносчіков і рослина-паразит березки.

Серологически метод діагностики

Метод заснований на реакції преципітації (утворення осаду) між специфічними антитілами і білками (антигенами) збудника захворювання. Метод серологічної діагностики непридатний для ідентифікації віроідов через відсутність білкового компонента, а також для ряду соконепереносімих вірусів зі слабкими імуногенні властивості. Для ідентифікації вірусів в рослині можуть використовуватися такі модифікації серологічної діагностики:

1) Імуноферментний аналіз (ІФА) - найбільш високочутливий метод, який дозволяє отримувати кількісні оцінки. В його основі лежить специфічне розпізнавання поверхневих антигенів вірусу антитілами, в присутності ферментів. Даний метод широко використовується на практиці для ідентифікації вірусів сільськогосподарських культур, підходить для серійних аналізів.

2) крапельний метод. Проводиться наступним чином. На предметному склі краплю соку рослини змішують з краплею антисироватки. Через пару хвилин проводять оцінку реакції під мікроскопом при малому збільшенні в темному полі або навіть візуально, без мікроскопа.

3) Метод подвійної дифузії - проводиться в агарових гелі, для визначення сферичних та інших дрібних вірусів. Проводиться за такою методикою, в одні лунки, які вирізані в шарі агарового середовища, додають антисироватки, а в інші - очищений сік рослини. У гелі вірусні частинки і антитіла дифундирует один одному на зустріч, і в місці зустрічі утворюють виразні лінії преципітації в разі їх компліментарної специфічності.

4) Метод радіальної імунодифузії. При використанні даного методу антисироватки додають безпосередньо в агарове середовище, при цьому лунки заповнюють соком рослин. Реакція є позитивною, якщо навколо лунок утворюються преціпітани в формі кілець.

5) метод адсорбції. Метод заснований на тому, що перед реакцією з антигеном антитіла пов`язують будь-яким інертним матеріалом з великими частками, наприклад, латексом. При реакції з антигеном відбувається добре помітна аглютинація всього комплексу.

Метод електронної мікроскопії

На ультратонких зрізах уражених тканин рослин, за допомогою електронних мікроскопів можна визначити будову, форму і навіть розміри вірусів або віроідов. Електронний мікроскоп нерідко використовують в поєднанні з серологічними методами (іммуноелектронная мікроскопія), при цьому можна виявляти вірусні частинки з нашарувалися антитілами. Метод електронної мікроскопії використовується вкрай рідко через високу вартість обладнання та реактивів, складності виділення вірусів і віроідов, окислення зрізів рослин і ряду інших факторів.

метод електрофорезу

Цей метод заснований на поділі попередньо очищених нуклеїнових кислот вірусу (віроїди) або його білків в гелі під дією електричного струму, з подальшим фарбуванням зон. Метод електрофорезу дозволяє визначити масу і розміри вірусних або віроідних структур. Метод широко використовують для візуального дослідження кінцевого продукту полімеразної ланцюгової реакції. Для реєстрації отриманих результатів роблять фотографії гелю в прохідному або відбитому світлі.

Молекулярно-біологічні методи засновані на знанні будови молекули РНК (ДНК) вірусу або віроїди. Найбільш поширеним тестом є ампліфікація (множення) видоспецифічності послідовностей РНК в ході полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Виділені з досліджуваних рослин окремі фрагменти РНК, специфічні тільки для одного виду або роду вірусів, багаторазово множать за допомогою ферментів у присутності праймерів (відповідних олігонуклеотидів). При цьому їх кількість в кінцевому продукті реакції перевищує вихідне число копій обраного фрагмента РНК в мільйони разів. Далі вірусні РНК (ДНК) виявляють методом електрофорезу в гелі або методом імунофлуоресценції. Метод набуває широкого поширення в практичних вірусологічних роботах.

Метод ДНК-зондів також заснований на принципі компліментарності нуклеїнових кислот. Синтезують специфічні зонди, які гибрідизуючою тільки з певними нуклеотидними послідовностями РНК вірусу або віроїди. Залежно від вибору зондів можна диференціювати групи, види і навіть штами вірусів і віроідов.

метод включень

Надалі розвитку вірусів, в клітинах рослин утворюються скупчення вірусних частинок, (включень), званих кристалами Івановського, які видно за допомогою звичайного світлового мікроскопа. Кожен вірус має свою форму вірусних включень, які утворюються, найчастіше, в клітинах епідермісу листя або в клітинах волосків. Наприклад, вірус тютюнової мозаїки має гексагональних і ігловідние крістали- Х-вірус картоплі характерне утворення сферичних аморфних тіл. Для виявлення вірусу зеленої крапчато мозаїки огірка, скручування листя картоплі і деяких інших застосовують хімічні аналітичні методи діагностики.