Методи інокуляції рослин

Перш ніж приступати до інокуляції рослин, їх слід підготувати. Вони повинні бути вільними від інфекцій, свідомо здоровими. Для цього піддослідні рослини найкраще вирощувати зі здорових насіння в оранжереї або вегетационном будиночку в вазонах (квіткових горщиках), заповнених вільної від інфекції грунтом. Насіння перед посівом знезаражують звичайними протруйниками, а грунт автоклавують під тиском 1-2 атм.

При вирощуванні рослини поливають, чи не зволожуючи поверхні листя і стебел (воду ллють безпосередньо на грунт або через спеціально вставлені трубки). По можливості виключають сторонню або випадкову інфекцію, переноситься комахами або через повітря.

Якщо піддослідні рослини в оранжерейному досвіді отримати з насіння неможливо, то беруть рослини, які ростуть в дикому стані, і пересаджують в горщики, після чого витримують в оранжереї протягом часу, рівного мінімум одному (бажано 1,5-2,0) інкубаційному періоду хвороби , заподіюваної досліджуваним грибом. Практично для цього цілком достатньо 7-10 діб.

При інокуляції рослин грибами в польових умовах необхідно намічені надземні органи попередньо ізолювати від навколишнього середовища заскленими дерев`яними каркасами, паперовими ковпаками, поліетиленовими пакетами, стеклами від ліхтаря «летюча миша» або ламповими стекламі- останні прив`язують до кілків, а верхнє і нижнє отвори закривають ватними тампонами . Така попередня ізоляція на строк до 1-2 інкубаційні періоди необхідна для того, щоб переконатися в дійсно здоровому стані піддослідних органів рослин. При цьому у всіх випадках прагнуть до того, щоб ізольовані рослини або їх органи розвивалися нормально, не були етіолірованнимі, хлоротичними, подвядшие і т. Д.

Можливе проведення дослідів на зрізаних частинах рослин, опущених у воду, в живильний розчин, а також на відокремлених листі, поміщених в розчин бензимидазола.

Прийоми інокуляції рослин досить різноманітні і залежать від біології гриба і ролі інфекції в патогенезі захворювання, а також від цілей дослідження (перевірка патогенності штамів, оцінка стійкості сортів і т. П.). Розглянемо ряд прийомів інокуляції, які досить добре перевірені і можуть бути рекомендовані в практичній роботі.

Інокуляцію рослин можна проводити як патогеном, які виросли на штучному живильному середовищі, так і природного популяцією суперечка гриба. Залежно від поставленого завдання використовують різні інокулюму -міцелій, суперечки, зібрані з одного сорту рослини-господаря або представляють географічну популяцію, і т. Д.

При виборі методу інокуляції враховують продуктивність праці, так як часто оцінці підлягають тисячі сортів. Способи і терміни штучного зараження по можливості наближають до природних. У всіх випадках створюють умови, оптимальні для зростання патогена (температура, вологість). Кількість інокуліруемих рослин має бути не менше 10 з обов`язковим контролем.

Ряду захворювань (курна сажка пшениці і ячменю, ріжки жита, гельміптоспоріоз ячменю і вівса, жовта іржа пшениці і ін,) властиво проникнення інфекції через квітки і зав`язі. В даному випадку інокулюють здійснюють нанесенням сухих спор або суспензії спор гриба в квітки і зав`язі. Наприклад, М. До Хохряков (1969) вказує, що найбільш простий метод інокуляції пшениці і ячменю курній головешок полягає в розпиленні хламідоспор збудників хвороби в період цвітіння злаків з марлевих мішечків або зрізаних уражених колосків.

В. І. Кривченко (1963) модифікував вакуумний метод інокуляції пшениці збудником летючої сажки за допомогою спеціального приладу, що складається з циліндра, в який поміщають колосся, що залишаються на корені. Цей циліндр має дві вивідних трубки, одна з яких з`єднана з насосами, а інша служить для подачі повітря. Знизу, через спеціальну вакуумну затискну пробку і шланг, подається суспензія спор (0,2 г суперечка на 0,5 л води). Суть методу полягає в тому, що в міру відкачування з циліндра з колоссям повітря туди надходить вода із суперечками. Після подачі повітря суспензія втекти назад в судину. Для отримання достовірних даних досить заразити 6-10 класів одного сорту, а при оцінці сімей і ліній гібридів-не менше трьох класів.

Е. Е. Гешель (1964) розділяє методи інокуляції курній сажкою на дві групи: індивідуального зараження квіток і всього колоса. У першому випадку ножицями зрізають один верхній і два нижніх колоска, а з інших пінцетом видаляють середні квітки. Після цього кожна квітка відкривають і пінцетом вносять суперечки. Цей метод має ряд модифікацій. Зокрема, заражати квітка можна за допомогою спеціальної піпетки з грушею. У другому випадку на здоровий колос наносять матеріал, що містить заразне початок сажкових, попередньо зробивши надрізи на рівні Колоскова зубця.

Інокуляцію квіток ячменю здійснюють конидиями збудника смугастого гельмінтоспоріозу за допомогою вакуум-приладу в період, коли колос ще не вийшов з трубки, з`явилися тільки кінчики остей.

Квітки плодових культур грибами роду Monilinia заражають, завдаючи сухі конідії зволоженим кінцем голки на рильце маточки. Потім квіти обприскують водою з пульверизатора і надягають на них змочений у воді марлевий ізолятор, який на добу покривають поліетиленовою плівкою. У південних районах, крім того, інокульовані суцвіття затеняют- приблизно так само роблять при зараженні класів.

Інокульовані гілки плодових ізолюють таким же способом, як і квітки. Якщо досліди проводять на зрізаних пагонах, то після нанесення інфекції на листя пагони поміщають у вологі камери, приготовані зі скляних ковпачків, що вистилають зсередини вологою фільтрувальної папером на 24 години при оптимальній температурі.

При нанесенні заразного початку на листя, стебла та інші органи рослин, як правило, застосовують суспензію суперечка (конідій) патогенів. Восковий наліт на поверхні листя ускладнює проникнення грибів, тому перед инокуляцией його видаляють, пропускаючи лист між вологими пальцями. Матеріал, що містить інфекцію, як правило, наносять на нижню сторону листа у вигляді краплі водної суспензії з пульверизатора або розтирають інокулюм по листу скальпелем. Іноді використовують сухі суперечки, які наносять на зволожені листя за допомогою стерильної пензлика.

При штучному зараженні листя безпосередньо на рослинах можна застосовувати малооб`ємні вологі камери у вигляді целофанових чашок (діаметром 20 мм), притиснутих по краях еластичною пружиною (метод М. С. Дуніна).

Інокульовані рослини на певний проміжок часу (12, 24, 48 годин) поміщають у вологу камеру для забезпечення більш повного зараження. У польових умовах цього досягають нанесенням суспензії спор в похмурі дні, або під вечір, особливо якщо очікується роса.

Інфекційний матеріал іржі хлібних злаків зазвичай готують за дві години до нанесення на рослини. Для цього беруть 200-300 уражених листя, занурюють їх у воду (0,5-1 л) і змивають з них уредоспори. На 150-200 м2 посіву витрачають близько 20 л суспензії (Л. Ф. Русаков, 1926). У стаціонарних умовах інокулюм готують заздалегідь в оранжереї або на спеціальних посівах. Для зараження ділянок - розповсюджувачів іржі слід брати 5 мг Уредоспори на 1 м2, распилівая їх разом з тальком в співвідношенні 1:30 або 1: 100. При суцільний інокуляції на 1 м2 витрачають 2 мг життєздатних Уредоспори в разі подальшого покриття рослин плівкою і 20 мг - без вологої камери (К. М. Степанов, 1966).

Штучне зараження рослин базидиоспорами іржі (наприклад, лінійної або бурою) здійснюють у вологій камері. Беруть частини рослин з розвиненими телейтоспори і поміщають їх над інокуліруемим рослиною c таким розрахунком, щоб у міру дозрівання базидіоспори опадали на його поверхню.

Є повідомлення про можливість інокулювати збудниками пірікуляріоза і борошнистої роси окремі листя злаків, які розміщені у вологі камери, а також невеликі гуртки живих листя (діаметром 12-14 мм) тютюну грибом Peronospora tabacinа. При цьому їх поміщають в чашки Петрі, дно яких вистелено трьома шарами фільтрувального паперу, насиченою без надлишку живильним розчином наступного складу (в г на 100 мл води): тартрат калію і натрію (косо-СНОН-СНОН-COONa) - 0,5 К2НРО4 - 0,1 KNO3 - 2,0 Со (N03) 2 -0,06- КСl - 0,03 МnO4 - 0,001 і Mg04 -0,5 (Isard, 1960).

При вивченні, наприклад, облігатньтх паразитів деревних порід застосовують спеціальні методи. При роботі з голосумчатих грибами, що викликають деформації плодів і гілок, для отримання аскоспор пагони з ознаками ураження, зрізані з хворих дерев, поміщають в судини з водою, які закривають широким скляним ковпаком. Під край ковпака кладуть прокладки висотою близько 10 см для доступу повітря. Через 1-2 дні на уражених органах з`являється сумчасте спороношение гриба. Утворилися аскоспори переносять стерильним скальпелем на досвідчені здорові рослини, на початківці розвиватися зав`язі або поткамі. При цьому лусочки примусово розкривають, Застосовують також і інші спеціальні методики, виходячи з біології патогенів, цілей експерименту і можливості проникнення інфекції при тих чи інших умовах (Гешель, 1971).

При роботі з збудником аскохітозу гороху, відповідно до методики Держкомісії з сортовипробування, інокулюм отримують в пробірках на косому агарі. З однієї пробірки культури гриба готують суспензію збовтуючи її в 1 л води. При цьому в середньому в одній краплі рідини повинно міститися 40-50 конідій патогена. На 1 м2 посіву витрачають 2 л суспензії.

Насіння можна інокулювати сухим або вологим способом. Заспореніе насіння практикують при вивченні твердої сажки пшениці. При цьому па 1 кг насіння витрачають від 1 до 10 г суперечка в залежності від очікуваних умов погоди під час посіву і в найближчі дні, при погоді, що не сприятливою для розлиття головешки, інфекційну навантаження збільшують Оптимальними умовами прийнято вважати температуру ґрунту на глибині залягання насіння 6 -10 ° С, Якщо випробуванню підлягають малі партії насіння, то їх обпилюють надмірною кількістю спор і пропускають через сито. У насіння ячменю і вівса для створення необхідної інфекційної навантаження слід видаляти плівки, причому Е. Е. Гешель (1964) рекомендує видаляти тільки ту частину плівки, яка прикриває зародок. В інших випадках насіння розсипають тонким шаром на щільному поверхні, обприскують суспензією спор, витримують у вологій камері. Насіння ячменю і вівса також успішно інокуліруют сажкою методом занурення в суспензію суперечка. Для 100 г насіння готують 100 см3 суспензії з 4-10 г суперечка. Насіння витримують в суспензії 15 хв, три рази ретельно збовтуючи суміш. Потім насіння поміщають в марлеві мішечки, дають стекти воді і витримують 24 год при 20 ° С Після підсушування насіння висівають.

Заспоренние сажкою насіння вівса з віддаленими плівками пророщують в ящиках при 25 -ї вологості грунту і температурі 20 ° С. Після появи сходів їх пересаджують в поле. Цей же метод Е. Е. Гешель (1964) рекомендує застосовувати при штучному зараженні ячменю сажкою і збудником смугастого гельмінтоспоріозу.

При інокуляції (штамбів) плодових дерев на корі через 1-1,5 см наносять два поперечних надрізу, між якими кору розрізають посередині в поздовжньому напрямку, відгинаючи її стулки, роблять кілька неглибоких надрізів деревини і вносять культуру досліджуваного патогена разом з шматком агарового середовища. Потім стулки кори закривають і місце зараження обтягують поліетиленовою плівкою або пергаментом, закріплюючи краю шпагатом або клейкою стрічкою. При застосуванні паперу під пов`язку поміщають зволожений шматок вати.

У разі зараження скелетних гілок патогенами, які можуть розвиватися тільки в попередньо ослаблених тканинах, останні біля місця інокуляції припікають.

При штучному зараженні деревних порід факультативними паразитами (гриби роду Cytospora та ін.) досліди краще проводити в лабораторних умовах на зрізаних пагонах. Для цього з випробуваного сорти зрізають здеревілі пагони довжиною 150 мм і товщиною близько 10 мм в кількості 20 шт. (По 10 шт. Для досвіду і контролю). Потім на відстані 50 мм від вершини втечі роблять виріз глибиною до 5 мм-після поверхневої стерилізації в нього поміщають агарове середовище з міцелієм гриба. Місце інокуляції обтягують поліетиленовою плівкою, яку по краях закріплюють нитками або ізоляційною стрічкою. Зі зворотного боку втечі під плівку поміщають вату, яку при необхідності періодично зволожують уколом шприца через плівку.

Живці ставлять в стакани з водою або з попередньо прожареним вологим піском. Перебуваючи у воді або піску, черешки починають відчувати брак мінеральних речовин грунту, їх життєві функції слабшають і вони гинуть. Цей процес відбувається протягом тривалого часу що дозволяє визначити терміни захворювання живців різного ступеня ослаблення, отже, хвороботворну здатність гриба і стійкість рослин.

Заражені пагони порівнюють з контрольними, використовуючи порядковий критерій X зазвичай в момент загибелі 2/3 живців самого чутливого сорту. У разі, коли по краях рани буде проходити посилене утворення каллюса, рану підчищають і проводять вторинну інокулюють, не перериваючи досвіду.

Сіянці деревних порід можна інокулювати шляхом введення інфекції в стебло за допомогою медичного шприца. Можна вносити інфекційне початок в корені безпосередньо в грунті, пошкоджуючи їх металевим стрижнем (спори патогена вводять в утворену рану).

Інокуляцію плодів і коренеплодів здійснюють нанесенням суспензії спор патогена на їх стерильну поверхню. При цьому можна використовувати також сухі спори, проколюючи або надрізу шкірку плоду, або вводити водну суспензію суперечка (1 краплю) шприцем під шкірку. Іноді інфекцію вводять в глибокий виріз коренеплоду, вставляючи потім вирізану частину на колишнє місце.

Найчастіше інокулюм вносять в грунт для створення інфекційного фону без пошкодження кореневих систем-попередньо гриб розмножують на спеціальних середовищах.

Для багаторічної роботи з великим набором видів і сортів рослин використовують різні інфекційні фони. Вони можуть бути природними і штучними, а також відрізнятися за ступенем прояву хвороби (слабкі, сильні).

При створенні інфекційного фону в грунті, наприклад збудників вілту бавовнику, спочатку вирощують чисті культури грибів в колбах зі стерильними насінням вівса (100 зерен на 100 см3 води). Потім культури розмножують в пляшках із середовищем того ж складу. На кожні 100 м2 площі вносять 3-4 кг культури (нижче описаний і інший метод).

Внесення культур грибів в грунт використовують також при роботі зі збудниками в`янення (вілта) баклажанів і перца- застосовують склероции патогенів в період бутонізації рослин з попередніми пошкодженням коренів.

Інокуляцію сходів ячменю і пшениці збудниками гельмінтоспоріозу, фузаріозу, Офіоболез і іншими патогенами проводять, вносячи культуру грибів в посівні рядки разом з насінням. Застосовують чисті культури грибів, вирощених на зернах або агарових середовищах (0,5 крохмалю, 0,02 КН2Р04, 0,02 Ca (N03) 2 0,02 пептона і 2 агар-агар). Використовують також заражену січку соломи. Рядки при посіві засипають зараженої соломою з розрахунку 20 подрібнених рослині в суміші з 1 кг перегною на 25 м посівного рядка (Е. Е. Гешель, 1964).

При створенні інфекційного фону збудників снігової плісняви ​​в грунт вносять суміш штамів (Fusarium nivale, Typhula incarnata і ін.), які попередньо вирощують на подкисленном картопляному агарі і потім розмножують на стерильному вівсяному зерні. Перед внесенням культури грибів в грунт їх змішують із землею в рівних кількостях і рівномірно розподіляють по поверхні ділянки. Інфекцію вносять в грунт восени з розрахунку 200 г культури на вівсі на 1 м2. Заражений ґрунт прикривають зверху шаром землі в 1-1,5 см. Перший рік на інфекційному фоні проводять рекогносцирувальний посів. Якщо при цьому випрівання рослин від патогенів буде рівномірним, то на наступний рік ділянку використовують для дослідів (В. К. Неофітова, Н. А. Новик, 1969).

Інфекційний фон іржі льону-довгунця (Меlampsora lini) Створюють за допомогою линяной соломи, ураженої збудником хвороби (смесьсортов). Таке солому (стебла) розстеляють з осені під сніг. Навесні уражені стебла 2-3 години витримують у воді і перевіряють схожість телейтоспори, пророщуючи їх на 50-100 відрізках стебел у вологій камері. Підрахунок пророслих спор проводять через 48 годин після їх приміщення у вологу камеру.

Перший спосіб застосовується при вивченні біології патогена і при інокуляції одиничних рослин, другий - при польовий оцінці сортів.

При створенні інфекційного (провокаційного) фону для збудника Вертіциллезному вілта бавовнику на ділянці в перший рік заорюють уражені грибом рослинні залишки (гуза-паю) і рясно поливають грунт. На наступний рік проводять зрівняльний посів чутливого до даного захворювання сорти бавовнику, після збирання врожаю, уражені рослинні залишки знову заорюють. Зрівняльний посів необхідний також і для того, щоб перевірити надійність провокаційного фону. Тільки після такої перевірки його можна вважати підготовленим для випробування сортів.

Зараження льону антракнозом (Colletotrichum lini) Проводять шляхом внесення інфекції в грунт і обприскування сходів спорової суспензією. Як інфекційного матеріалу використовують уражену солому льону і сходи, а також чисту культуру патогена, вирощену на вівсі і сусло-агарі. Для зараження грунту чисту культуру гриба, хворі сходи і солому льону закладають у верхній шар грунту. Вегетуючі рослини інокуліруют спорової суспензією в фазі сходів (Т. В. Крилова, Ю. Т. Карпуніна, 1969).

При зараженні білою гниллю соняшнику (Sclerotinia libertiana) Застосовують спосіб, при якому одночасно з насінням в кожне гніздо вносять за допомогою ручної садильники 2-3 невеликих склероция збудника хвороби. Зазначений метод дозволяє отримати ознаки хвороби на прикореневій частині стебла (А. І. Лукашевич, 1969).

Збільшення запасу інфекції несправжньої борошнистої роси соняшнику (Plasmopara helianthi) Проводять наступним чином. Спочатку готують суспензію зооспор, для чого у вологі камери поміщають уражені листя і шар вологої фільтрувального паперу. Вологі камери витримують за температури 16-20 ° С. Дозрілі конідії знімають з поверхні листя лезом бритви або вологим тампоном і готують суспензію. Інокуляцію рослин здійснюють витримкою в суспензії насіння, що надзьобалося протягом 5-8 годин при температурі 17-19 ° С. Потім проростки соняшнику висаджують в ящики розміром 50 × 40 × 15 см, парники або відкритий грунт. У ящиках і парниках рослини розміщують за схемою: між рядами 10-15 в ряду 2-3 см-у відкритому грунті - Між рядами 45-60 і в ряду 3-5 см.

Збудника склеротініоз конюшини вирощують із склероциев на скибочках картоплі у вологій камері. Потім скибочки з розвинувся міцелієм паразита розміщують під рослинами у кореневої шийки.

Аналогічними способами досягають збільшення кількості інфекції в грунті шляхом багаторазового внесення в неї рослинних залишків, заражених збудниками несправжньої борошнистої роси соняшнику, прикореневої і кореневої гнилями пшениці і ячменю, кили капусти, аскохітозу гороху і ін.

Грунтові патогени (гриби родів Verticillium, Fusarium та ін.) плодових і ягідних культур попередньо розмножують в чистих культурах на живильному середовищі. Зазвичай в якості поживного субстрату використовують зерна злаків, які заливають водою в колбах (приблизно в співвідношенні 1: 1) і стерилізують в автоклаві при тиску в 1 атм. Потім в колби з зерном вносять інфекцію відповідного гриба і витримують 10-15 діб з періодичним струшуванням для перемішування субстрату. При цьому насіння голозерних культур (пшениця, жито, зернобобові), щоб уникнути утворення кашкоподібної маси, змішують з половою або дрібно нарізану соломою.

Норми внесення в грунт такий грибний культури варіюють в залежності від виду патогена і сорту рослин. Як прідержкі можна прийняти, що слід вносити 3 кг культури на 120 м2 плантації ягідників чи 1,5-2 кг на площу харчування одного дерева (в залежності від схеми посадки).

Таким чином, вищевказані методи інокуляції рослин дуже різноманітні, з деякими змінами вони можуть бути застосовані для роботи майже з усіма фітопатогенними грибами на самих різних сільськогосподарських рослинах.