Виділення фітопатогенних грибів в чисті культури

Як вказав Н. А. Наумов (1937), сукупність прийомів виділення і культивування грибів змінюється в досить широких межах залежно від мети дослідження. Однак принципова схема дослідів укладається в одну систему. Перш ніж отримати досліджуваний гриб в чистій культурі, необхідно мати спороносную тканину або міцелій, вільні від зараження епіфітна мікрофлорою, яка іноді спотворює картину, ускладнює ідентифікацію і ізоляцію з уражених тканин.

Одним з найбільш простих методів отримання міцелію або органів спороношення (в тому числі і ряду облігатних паразитів) є застосування так званих вологих камер. Для їх виготовлення зазвичай використовують чашки Петрі або Коха. Дно чашок і внутрішню поверхню кришок вистилають колами фільтрувального паперу відповідного діаметру, стерилізують при температурі 110 ° С протягом двох годин і зволожують стерильною водою. Невеликі частини досліджуваних тканин в кількості 3-10 зразків після поверхневої стерилізації розкладають на дно чашок безпосередньо на фільтрувальну папір рівномірно по її поверхні.

Поверхневу стерилізацію частин хворих тканин можна проводити із застосуванням полум`я спиртового пальника (фламірованіе), струменем води або спеціальними хімічними речовинами. Метод поверхневої стерилізації природного субстрату придатний для деревини, коренів, насіння або плодів. Чим об`ємніший стерилізується об`єкт, тим ретельніше і довше можна його прогрівати, не побоюючись за життєздатність міцелію, що знаходиться всередині тканин.

Іноді необхідно виділити патогенний гриб з напіврозкладеного матеріалу або багнистих частин рослини (перітеціі парші на опалому листі і т. П.). В цьому випадку досліджуваний об`єкт поміщають на дрібне сито і промивають кілька годин під струменем води.

Надалі взятий для дослідження матеріал додатково очищають і дезінфікують з поверхні зануренням в одне з наступних речовин: 96-або 50-іий спирт на 2-3 хв-розчин сулеми (0,1-ний) з експозицією від декількох секунд до трьох хвилин- 0,5-1,0-ний розчин марганцевокислого калію (до 20 хв) - освітлений розчин хлорного вапна (1-ний) - 0,1-1,0-ний розчин бромної води (па кілька секунд) або в розчини інших дезінфекторів з наступним промиванням у стерильній воді. З цією ж метою може бути використаний розчин формаліну 1: 300 з подальшим томлінням об`єкта в посудині з його парами від 30 хв до 2 год.

Дослідження грибів, що розвиваються у вологих камерах, слід проводити безпосередньо в чашках при малому збільшенні мікроскопа в прохідному або відбитому світлі.

Після появи спороношення або ознак розвитку міцелію його пересівають на агарове живильне середовище безпосередньо в пробірку на косою агар або попередньо на агарове середовище, розлиту в чашки Петрі. Облігатні паразити вирощують на живих рослинах або спеціальних середовищах.

Для подальшої роботи дуже важливо провести очищення культури. Це здійснюють штриховий розводкою, розведенням в стерильній воді або за допомогою пробірок.

1. Невелика кількість гриба беруть на культуральне петлю і наносять штрихом на поверхню агару в чашки Петрі. У міру продовження штриха суперечки все більше розділяються до тих пір, поки в результаті не виходять індивідуальні колонії, що виникли з кількох або одиничних суперечка.

2. Інокулюм суперечка поміщають в пробірку зі стерильною водою (10 мл), потім стерильною піпеткою переносять певну кількість суспензії (наприклад, 1 мл) в пробірку з 9 мл стерильної води. Свіжа стерильна піпетка використовується, щоб змішати рідину і перенести 1 мл її в чергову пробірку, що містить 9 мл стерильної води. Розведення продовжують в міру потреби. Таке десятитисячне розведення має деякі переваги перед штриховий розводкою. В останньому розведенні 1 мл спорової суспензії додають до розплавленого агару, охолодженого приблизно до + 40 ° С.

3. Беруть п`ять пробірок відповідної агарового середовища, розплавляють її і охолоджують до + 45 ° С. Потім в одну з пробірок вносять невелику кількість спор пробірку прокручують між долонями і вміст виливають в чашку Петрі. Спорожнену пробірку знову наповнюють з іншої пробірки розплавленої середовищем, прокручують між руками і виливають у другу чашку. Цю процедуру повторюють з іншими трьома пробірками середовища.

При проведенні теоретичних досліджень або аналізі популяції будь-якої географічної форми виникає необхідність отримання культури з однієї суперечки. Практично моноспоровую культуру багатьох грибів отримують наступними способами.

1. Готують слабку суспензію суперечка на стерильному предметному склі в стерильній воді зануренням обпаленої зволоженою петлі в спорулирующих культуру. Цю суспензію суперечка наносять штрихом вздовж наміченої лінії в чашці Петрі на дуже тонку пластинку агару, приготовлену на кип`яченій воді, і витримують при + 24 ° С. Якщо це зроблено в 16-17 год, то в 9-10 годин на наступний день зазвичай спостерігають початок проростання і готовність суперечка для ізоляції.

При роботі з бинокуляром (стереоскопічним мікроскопом) чашку Петрі переміщують уздовж лінії позначки і вибирають відповідні пророслі спори. Відповідною голкою роблять виріз ангара площею близько 2 мм навколо суперечки. Цей квадрат і зону безпосередньо навколо нього перевіряють під малим збільшенням біологічного мікроскопа, щоб гарантувати наявність тільки однієї суперечки.

Агаровий блок з пророслої спорою потім переносять за допомогою стерильної голки під бинокуляром в чашці з агаром або пробірку.

2. Живильне середовище розливають тонким шаром у стерильні чашки Петрі, потім беруть пробірку зі стерильною водою і в неї вносять невелику кількість спор досліджуваного гриба і ретельно збовтують в воді. Після цього металевою петлею беруть 4-5 крапель спорової суспензії і переносять на предметне скло. Під мікроскопом підраховують кількість спор в кожній краплі. Якщо крапля містить в середньому n суперечка, то в пробірку додають стерильну воду, щоб обсяг її збільшився в n+1 раз.

При цьому можна вважати, що в одній краплі буде в середньому по одній суперечці. Після цього з пробірки з розведеною суспензією спор беруть 3-4 краплі і переносять в чашки Петрі на агарове середовище. Краплі повинні відстояти один від одного на порівняно великій відстані. Під мікроскопом перевіряють кількість спор, що потрапило в кожну з цих крапель. Перегляд ведуть з нижньої сторони чашки, яку для цього обережно перевертають. При цьому вибирають ті з крапель, в яких міститься по одній суперечці, і відзначають їх на склі восковим олівцем. Отримані в чашках Петрі колонії відсівають в пробірки на косою агар.

Іноді краплю суспензії, що містить одну спору, поміщають на стерильне скло в чашку Петрі і додають в неї шматочок агаровой середовища-після обростання його міцелієм гриба культуру переносять в пробірку або чашку Петрі.

3. Хансен (H. R. Hansen, 1926) використовував тонкі скляні капіляри, що опускаються з суспензією спор в теплу агарове середовище. Ці капіляри потім перевіряв мікроскопічно і розрізав на шматки, в кожному з яких містилося по одній суперечці. Такі шматки потім піддавав поверхневої стерилізації і поміщав в чашку з агаром.

Можливе використання і інших методів отримання моноспорових культур, які вказані в спеціальній літературі (наприклад, метод «сухої голки» Ханна і ін.). Так, для отримання моноспоровой культури від Уредоспори іржі хлібних злаків їх струшують на сухе предметне скло. Потім кінцем відтягнутою скляної палички відокремлюють одну спору під бинокуляром або при малому збільшенні мікроскопа. Кінець палички попередньо протирають ватою, змоченою денатуратом або спиртом. Виділену спору переносять в краплі води на лист рослин. Такі маніпуляції проводять приблизно 200 раз, маючи на увазі, що приживлюваність зазвичай становить 6-10.

При виділенні монопустульной культури гриба попереднє розмноження популяції іржі проводять так, щоб на листках утворилися одиничні уредопустули. Для цього при інокуляції використовують невелику кількість спор.

Після отримання початкових пустул в результаті моноспоровой або монопустульной культури гриба приступають до розмноження суперечка в них на певних сортах, повторюючи процес перезараженія рослин добре розвиненими уредопустули 2-3 рази. В результаті накопичують достатню кількість інокулюму для подальшої роботи з ним.

Виділення чистих культур з різних органів і тканин має свої особливості. При поверхневих пошкодженнях плодів соскабливают зовнішній пошкоджений шар і пророщують грибницю у вологій камері з подальшим пересівом колонії на агарове середовище. Попередньо уражену поверхню ретельно промивають стерильною водою.

При виділенні культур з внутрішніх частин плода їх ретельно промивають, дезінфікують в сулеме (1: 100) протягом 5 хв, після чого знову промивають у стерильній воді-вирізані з внутрішніх тканин стерильним скальпелем шматочки плода розкладають на поживний агар.

При виділенні патогенів, що викликають зовнішні пошкодження коренів, використовують методику, описану для плодів. При внутрішніх ураженнях коріння ретельно промивають, фламіруют, після чого роблять поперечні або поздовжні зрізи. Отримані невеликі шматки внутрішніх уражених тканин пророщують на агаровой живильному середовищі.

Ізоляція грибів з листя, пелюсток і інших ніжних органів пов`язана з відомими труднощами, так як в даному випадку майже повністю доводиться відмовлятися від поверхневої стерилізації за допомогою хімічних речовин, які можуть вплинути на міцелій патогена, що знаходиться в мезофіли. Для підвищення точності і достовірності роботи по виділенню слід використовувати максимально дрібні частини тканин, збільшуючи зате їх загальна кількість.

Гриби, які вражають кору і деревину (трахеомікоз, гнилі, некрози), можуть бути виділені безпосередньо з уражених тканин шляхом посіву поверхнево простерилізованих шматків або зрізів на поживні середовища або з суперечка і міцелію, отриманих у вологій камері. Деревина та кора повинна бути свіжими, оскільки в залежалих зразках розвиваються цвілеві гриби, що засмічують культуру.

Уражену деревину дезінфікують зануренням на декілька хвилин в 95-ний спирт або 0,5-ний розчин перманганату калію з наступним фламірованіем. Потім стерильним скальпелем або мікротомів зрізають поверхневі частини зразка, а з внутрішніх вирізують пластинки товщиною від кількох мікрон до 5-10 мм і переносять їх на поживне середовище.

При виділенні культури з плодових тіл гименомицетов спочатку зрізають поверхневий шар, а з внутрішньої частини плодоносца вирізують невеликі шматки - 4-5 мм в діаметрі і занурюють їх наполовину в живильний агар. Потім розвинулася грибницю переносять на косою агар.

Для виділення ендогенної грибниці з молодих сіянців уражені здебільшого не стерилізують, а тільки промивають, щоб не вбити її-матеріал злегка розщеплюють і поміщають на поживний агар або у вологу камеру- з`явився міцелій швидко відокремлюють, намагаючись не допустити розростання сапрофітних мікроорганізмів.

Більш старі сіянці дезінфікують в 0,5-ном розчині марганцевокислого калію, промивають водою і кладуть у вологу камеру, звідки розвинулася грибницю переносять на живильне середовище. Можливо також використання зрізів стебла, які розкладають на агар для пророщування міцелію патогенних грибів.

Мікрофлору хворих насіння зазвичай аналізують після розвитку її в культурі на живильному середовищі (М М. Самуцевич, 1931). Для цього з партії насіння з різних місць беруть загальну пробу, відраховують 200 насіння і по 25 штук розкладають в чашки Петрі на агарове середовище.

При визначенні поверхневої інфекції насіння не стерілізуют- для встановлення глибинного зараження їх протягом 2-3 хв витримують в марганцевокислого калії (0,5) або на 1 хв опускають в чистий спирт.

У деяких випадках продезінфіковані насіння розрізають на дві частини стерильним скальпелем. Сильно муміфіковані насіння попередньо витримують на фільтрувальної папері, зволоженою стерильною водою-після підсушування і фламінірованія поміщають в чашки Петрі. У міру появи спороношення патогенів їх переносять на косою агар.

При виділенні чистої культури гриби попередньо вирощують на злегка підкислених агарових середовищах або желатині (Н. А. Наумов, 1937). Під час початкової ізоляції патогена не можна використовувати рідкі або сильно зволожені середовища, так як це сприяє розвитку сапрофітних мікробів. Не слід також сіяти патогенні гриби на тверду живильне середовище: рис, картопля, хліб та інші продукти.

Для виявлення патогенів, що зберігаються в грунті, з метою їх подальшої ізоляції беруть зразки з характерних грунтових різниць (підзол, чорнозем, серози і ін.) На різній глибині з-під певних культур і т. Д. При взятті проб роблять грунтовий зріз потім стерильним інструментом відокремлюють потрібний шар, з якого і беруть пробу в 10-20 г, поміщаючи її в стерильну посуд або конверт. Рекомендується брати грунт з верхнього стоячи (до 3 см) і глибше, на рівні розташування основної маси коренів. Для повної характеристики ділянки необхідно отримати за три роки відомості про попередніх культурах і кислотності грунту (рН).

При вивченні розподілу інфекції в поле грунтові ями виривають через кожні 5 м на однорідному участке- для рекогносцирувальна обстежень досить 5-10 ґрунтових ям на ділянку.

Зібрану грунт протягом декількох днів висушують до повітряно-сухого стану в паперових конвертах, подрібнюють і висівають на агарове живильне середовище за допомогою стерильних шпателя, скальпеля та інших інструментів. Кожну пробу (10-20 г) розподіляють на 6-7 чашок Петрі, потім витримують чашки в термостаті при температурі 20-25 ° С і періодично переглядають. У міру розвитку колоній грибів їх переносять на косою агар в пробірки. Наявність ізольованих грибів визначають звичайними способами. Після 7-8 днів з моменту початку зростання колоній чашки стають непридатними для відсіву грибів у зв`язку з забрудненням середовища сапрофітними мікроорганізмами.

Вивчення грунтових грибів-мікроміцетів можливо шляхом виділення їх в чисту культуру або із застосуванням методу «пластинок обростання», грунтових мікрокамер, педоскопов, виготовлених з дуже тонкого скла, та інших прийомів.

Виділення мікроорганізмів, в тому числі і фітопатогенних грибів, в життєздатному стані з водної та повітряної середовищ - область спеціальних досліджень. Існують різноманітні методи аналізів із застосуванням відбірників, автоматичних об`ємних і інерційних спороловушек (Ф. Грегорі, 1964- Ю. П. Бочков, А. І. Воронова, В. Ф. Думский, 1966- А. І. Клочко, 1969, і ін .).